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プラスミドミニプレップキットどれが良い?

1 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/14 21:59
少量(数μg〜数十μg)のプラスミドを回収,精製する
キットは,
concert(インビトロジェン→マーリジェン)
quantum(バイオラッド)
wizerd(プロメガ)
など各種,各社から発売されていますが,回収量,精製度,処理時間
等また,回収したプラスミドの使い勝手(〜ではシークエンスはムリ
とか,回収量が低いのでエタ沈必須)とかキットあるいは,各種精製
方法について教えてください.

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/14 22:05
BIORADのキットってどうですか?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/14 22:52
以前共同研究してるラボが使ってたんでミニプレキットを買ってみたが、
思ったほど収量は、良くなかったような気がした。今は、普通にアルカ
リSDS法で回収している。
余計な金もかからず、一番良いと思うが。それとも、キットの使用法に
は取説にはない秘訣があるんか。


4 : :02/07/14 23:36
おれもしりたい。
いい加減にアルカリ法やりたくない。
遠心して終了なんてのはないのか?

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/14 23:45
そう思います。DH5αかXL1をホストに使うとフェノクロする必要がありません。冷やして置くのを省略してすぐに遠心してどんどんやれば30分ぐらいで終わります。

6 : :02/07/14 23:49
いや、だから、それはしってるけど、
もっときれいではやいの教えて。
かねはかかってもイイから。

7 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/15 00:35
ミニプレップ用ではないと思うが
やはりプラスミド回収にはキアゲンがイイ

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/15 02:31
どうせアルカリ法でやってるんだから、時間を短縮するにはエタチンの処理を
どう短くするか、にかかってるんだよね。でそんなに変わらないわけで、
どうしてもと言うなら吸引式でも出来るやつをおすすめする。遠心して捨てて、
洗って捨てて、なんてやってられん。(といいつつ最後の溶出に遠心したりして)

うちは普通のアルカリ法でシーケンスやってるから、キット使うとかえって手間
だと思う。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/15 11:53
ボイルして遠心(デブリ沈殿)上澄みでSEQ
これ最強。

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/15 11:59
それじゃシーケンスよめないでしょ?
MacheryNagelのキットで精製したplasmid
調子いいと800くらいまで
NNNがはいらないで読めてるよ!

11 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/15 13:59
QIAGEN最強

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/15 18:39
クラボウの抽出機が最高!!
培養液を減らせばseqもOK!

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/16 03:04
キアゲンとファルマシアと自分で試薬作ってアルカリ法の3パターンをやったことがあるけど
キアゲンが圧倒的にいいな。キアゲンのmini prep kit。15分で終了するし収量も純度もイイ!
唯一の欠点は他の2つに比べて割高なこと。

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/16 05:51
concert は入手ルートによっては最高に安く、ゲルシーケンスなら 600 位まで N なしで読める。欠点は、キャピラリーでは半分くらいの確率で読めない。不純物(成分未だ不明)のせいで吸光光度計で濃度が正確に測れない(数倍高く表示される)。収量低い。
quantum はゲルでもキャピラリーでもシーケンス読める。収量も高い。濃度も concert よりも正確に測れる。欠点は、なぜか linear が出る。制限酵素で切らなくてもサイズがわかるから、ある意味利点かも・・・。
この二つのキットの共通の欠点は、変性した DNA が少量含まれ、それは制限酵素で絶対に切れないこと。トランスフォーメーションしたら、絶対切れのこりを持ったコロニーが生えます。
QIAGEN はシーケンスも完ぺき、濃度も正確に測れて、11 さんの言うように最強でしょう。変性 DNA もカラムを通すとどんな原理か不明だがきれいに除けることを確認済み。欠点は値段が高い、ぐらい。
WIZARD plus は使ったことないけど、QIAGEN なみにいいという噂。値段も近いし、試してみては。
ただ、キットってけっこう OC が入りやすい気がします。その点では、manual でアルカリ法が1番きれいですが・・・。収量もいいし・・・。でも、僕は必ず切れ残る・・・。
これらを考慮し、僕は上の方法全てを使い分けています。

15 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/17 01:51
>>14
concertについては、確かにそう思う。吸光度を測定して計算した濃度と、
アガロースゲル電気泳動による濃度の見積もりは、かなり異なると思う。
俺なんて、concertを使って100 ng/microL以上とれたことがない。

でも、周りには愛好者がいてコンスタントに、300〜400 ng/microLの濃
度を確保してる奴もいるんだよな。(vectorはhigh copy)
この違いはなんなんだろ。コツを御存知の方いらっしゃったらご教授願い
ます。


16 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/17 03:29
確かにいろいろあるけどQIAGENが最強です。
これでとったプラスミドはそのまま細胞にtransfectionできる。
IRES-EGFPをHelaに入れてみたけど、結果はビカビカ。
単なるインサートチェックなら普通のアルカリ法でいいと思う。
けどインサートチェックならコロピーが最強。当然使用するTaqはZ-Taq。
コロニーつついてから1時間で結果が分かる。


17 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/19 01:00
>>15
確かに、コンサートマニュアル通りにやってもそのくらいしかとれませんね。

どなたかコンサートの使い方、私にも教えてください。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/20 23:22
シーケンスが目的なら、自分でアルカリ法が一番早い。1サンプルなら10min、
12サンプルで20minくらい。シーケンスの邪魔になるのはタンパク質じゃなく
てRNAのコンタミだから、最後に溶解するTE+RNaseAのRNaseAの濃度を濃い目
(100μg/ml)にする。クラボウのミニプレップマシーンでもOK。キアゲンで取
ったものに比べても、シーケンスに関しては遜色ない。

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/20 23:23
追加
endAの大腸菌なら、もちろんPhOH抽出も必要ない。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/20 23:31
やっぱクラボウか、、。
なんせ全自動だもんな。

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/21 00:09
12サンプルで2時間、24サンプルで2.5時間ってのは、もうちと何とか
して欲しいところだけどね。それと無駄に大きい。中はほとんど空っぽ
だもんね。SO○Yが作れば、1/5のサイズになるだろう。

22 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/21 00:14
>>21
>中はほとんど空っぽ
発売初期のモデルでは、中にクラボウのおじさんが入っていて
アルカリ法を手動でやっていたのだ。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/22 00:39
>>21

>無駄に大きい

空冷など、諸事情があるんだろうよ。
ウォークマンとは違い、そう簡単には小さくできないんじゃない?

あれだけ売れてるんだから、大きさの分差し引いても良い機器なんじゃない?
オレは3日に一度位使ってるけど、制限酵素処理、シークエンスともに
殆ど問題無いが。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/22 00:46
ウチはクラボウの機械の5連のプラスチック容器をそのまま培養チューブとして使っている。
プラ容器をヲートクレーブしたら培地を入れて植菌して専用のラックに仕掛けてシェーカーで振っている。
シェーカー内でプラ容器の蓋をしないで振るのはなんか気になるが問題が起きたことは無い。

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/22 00:58
ぎちぎちに詰め込むとメンテナンス性が悪くなる。
また隙間を無くすために専用部品を作ったりしていると
金型代が製品価格に跳ね返る。売れてるといっても世間
一般の工業製品とくらべれば少量生産。

まあ、もう少しは小さくできるだろうと思うが。
オレとしては、大きさはあのままでいいから、試薬ストック
の物置を下につくって欲しい。

26 :サンプル動画:02/07/22 01:00
   ,,-'''''''''''''''-,,
  ,/::/::::\\:::\
  /:::::/:/::::|i::i::i:::i:::::::::i
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  i::|::|   ┌┐   |::|::/ <http://csx.jp/~madrix/page002.html
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     /ヽフ\ |)ヽ +
  ΛΛ ̄|"| ̄ヽ|) ノ
  (。 。 ) | l| ヽ( ξ)
  ∪∪|__|-|___,,l
  |; | i    |
   | ・ || i   |
   U U.|_______,|
    /__ノ\ ヽ
     ̄    `-'
コギャル動画、素人動画のサンプルが大量に!!

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/22 03:19
BIORADのって誰か使ってませんか?
あと最近出てきた国産キット?

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/22 04:31
>>20
全自動あるけど誰も使ってないよ。

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/22 17:44
XYZ

30 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/23 02:01
GFXカラムだっけ?量少ないけどきれいに取れるから好き。
10分で16サンプル(遠心機1個分)いけるし、最後少なめの水で抽出すればそのままシーケンスできる。
シーケンスきれいだし。
ミニプレ10分PCRが1時間でシーケンス4時間。朝はじめて、お昼には結果出ちゃうよ。便利になったもんだ。
一昔前ならシーケンスなんて2日がかりの大仕事だったのに。


31 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/23 03:05
ほおほお。

GFXとかいあじぇん、どっちがええの?
っていうか、クラボウでシーケンス、そのままできるの?
おれはいつもふぇのくろ、ペグチンしてたが。

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/23 09:33
クラボウでそのままシーケンスできますよ。きれいに精製したDNAに比べて
それほど遜色ありません。

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/24 19:38
クラボウって名前初めて聞いたけど、そんなにいいのか?
そもそも全自動ってなんだ?洗濯機か?

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/24 20:07
30さん、
平均的に、なんベース位読めるか
教えてくらさい

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/24 22:53
アルカリ法でもシークエンスなら400bpは読める。
transfection 以外のたいていの用途には使えるんじゃないか?アルカリ法で・・・
話の流れにあってないのでsage


36 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/24 23:13
>>32
ホントに?
エラーおおそう


37 :ぺー:02/07/24 23:41
キアゲン最高。シグマはいやだ。

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 00:43
>>35
Machery NagelのNucleo Spin,templateたっぷりつかえば900くらいまで。
コンスタントに600は読めてるよ。

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 01:02
コンサート安くてイイ!

40 :ポスドキュン ◆yv7nVpfU :02/07/25 02:04
クラボウはそのままでもいけるけどリチウム沈しとくと700bpぐらい読める。
そのままだと500bpくらいなら綺麗に読めてた気がするが。

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 05:02
ミニプレなんかにキット使うなんて。我々には信じられない。シークエンスも、ペグチンでばっちりですよ。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 10:51
>>41
あほ。time is moneyだろ

43 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 21:08
キアゲンのキットってどこでRNase失活するんですか?
どうも最後までしていない気がしますが。

その点、プロメガWizardは塩酸グアニジンを加えた時点で失活しそう。

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 22:11
>>43
しっかつしませんよ。そんなもん(w
ちゃんとやってりゃRNase入りで泳動しようが何しようが平気。

おれはもう5年間RNaseしっかつさせずに泳動やらえたチンしてるけど、
insituもライブラリーも問題なく作れてるよ。

45 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/25 23:04
シグマ昔最悪だった。でも最近のはいい感じですよ。
頼めばサンプルくれるし...ちなみにウチは全院生がサンプルもらった(^o^)丿

46 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/28 19:00
>>42
だから、シーケンスぐらいならPEG沈もPhOH抽出もいらないから、ただのアルカリ法が一番早いんだって。ちまちまカラムかけたりするよりずっと。

47 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/28 22:37
クラボウの新型、少し小型になったのが発表されてなかったっけ?

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/29 00:29
ということで、ミニプレプキット使ってるやつはヘタレということでよろしいか。

49 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/29 07:36
その通り。
Midiprep Kitなら許す。



50 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/29 08:49
先週100サンプルほどアルカリ法でミニプレしましたが、何か?

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/29 09:50
トランスフェクションでもないのにカラムキットなんかつかうな

52 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/29 19:29
>>50
アホですね

53 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/03 22:01
ひゃっほー!

54 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/03 22:47
キア最高。

55 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/09 08:40
プラスミドのことについて聞きたいことがあるのですが、
大腸菌のプラスミドは原核生物だから導入すればその場で発現できるけど、
植物などの真核生物の場合、
プラスミドを導入すると核に移行して発現するの?
普遍的プロモーターは核に移行して初めて動き出すのかしら?
移動するならどのようにして移動するのですか?
移動しないならその場で発現できるメカニズムを教えてください。
突然で申し訳ないです。。


56 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/09 08:57
>55
それは自分も前から不思議に思ってましたが結局の結論は
「よくわからん」です。

一応推測されているのは、核移行して一部は 染色体に組み込まれ安定に発現する
大部分は核で転写因子をplasmid上に集めて転写され、その後核外に排出され
細胞質で分解される、これらの移動は細胞膜付近から核膜付近までは
エンドサイトーシスの経路に近く、その後、核内部へは何かのcargo蛋白に酔って
運ばれるかも知れないが、未知。核外への以降はその逆か全く独立かのいずれか。
分解の機構もよくわからんのです。あと分解されないのはoriginを中心に
複製されて細胞分裂とともにM期に分裂する。

だけどひょっとしたら全然違うかも知れ無いですねえ。
不思議ですね。分かって無いのに日常的に行われるのは。
よくわからんです。






57 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/10 22:39
>56
ありがとうございます。そうですか、わからないのですか、、、
私がなんとなく想像していたのが、
Tiプラスミドのように組み換わるのかと考えていたのですが、
それには組み替えの配列が必要ですし、
組み替えには何百ベースは必要だと聞きました。
何だかわからなくここに書き込みさせていただいたのですが。
ありがとうございます。

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 12:08
上げて見よう

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 20:12
そうだね

60 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 22:51
場の流れは変わっていたが、ちょいと書かせてね

シーケンス用のミニプレップなんてsol.I-III入れたら、イソプロで落として
ある程度乾かしたらTE溶かして1/20量使えば5-600は読めるでしょ。
RNAなんて何も悪さしないと思ってたけどな。

61 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/30 09:40
蛍光ダイターミネーター使ったシーケンスなら、RNAが残ってるとプライマーになる。ダイプライマーなら良いかも知れないが。

62 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/30 10:15
ミニプレでキットなんかいらんと思ってた。
キットの方が金と時間と手間ががかかるし、変な注射器組み立てたり、サクションしたり面倒。
自分らがボイリングアルカリって呼んでる方法だと、
ワンチューブでできるし、途中20分60度というインキューベートがあるけど、
手間は少ない。これって上のアルカリSDSのことだろか?

遠心して、溶解液いれて、ボルテクスして、ボイルして、また遠心して、
ペレットすてて、アルカリ液いれて60度20分放置して、エタ沈。
オートパイぺッターがさえ有ればたいしたことないと思う。

63 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/30 21:43
そいつは「ボイリング法」じゃ!アルカリ入れて60度ってのは、RNAをアルカリ
分解してるだけだから、最後にRNase A入りのTEに溶解するなら、そのステップ
も省略できる。またアルカリ入れて熱処理するとDNAに修飾が入るから、シーケ
ンスなんかには問題ないけど、そこから取ったフラグメントを使って次のプラス
ミドのコンストラクションをするのは凶。

64 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/01 00:25
普通のボイリング法ではあそのアルカリステップはなしで、
その代わりフェノクロ抽出するプロトコールでしょう。
上記方法の方がはるかに楽。

65 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/01 00:32
フェノクロ抽出もシーケンスや制限酵素の切断パターンを見るなどの目的なら全く不要。何のためのボイリングだと思ってるの?

66 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/01 00:39
しつこいようだがアルカリ条件で熱処理は塩基に修飾が入るから(マクサム・ギルバートの反応を参照)クローニング目的には使っちゃだめ!

67 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/02 10:15
オートパイぺッター
ってなに?一定容量を連続してブンチュウできるやつのこと?
結構つかえる?
みんな持ってるの?
かおっかな

68 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/02 19:52
ペグチンせずにdye primerでseq.してみました。
確かに500以上読めますが、ペグチンした場合より、精度がやや低いと感じました。


69 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/04 23:28
>68
当たり前。

70 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/23 21:38
>55,56
なるほど。。。共感しマスタ。
やっぱり謎ですよね。
オレも長い事トランスフェクションしてきたが、
いつも疑問に思っていて、
周りに聞いても首をかしげていました。
56さん以外の意見も聞かせて欲しいですね。

ところで、ミニプレで取ったプラスミドで、
トランスフェクションってどんなもんでしょ?
キアゲンさんに聞いたら、ミニプレカラムで取ったものは
お勧めできないっていってました。
けど、いちいちミディするのだるいよね〜

71 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/23 22:01
ロボットがプラスミドとってくれるよ〜

72 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/23 22:18
ロボットのじゃ、まずトランスフェクションできまい。


73 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/23 22:31
いっぱい切った貼ったの時には便利だよ!

74 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/23 23:34
トランスフェクションつったって、COSに入れて発現確認する程度の実験
ならミニプレで大丈夫なことも多いよ。96穴でミニプレップして、96穴で
COSにトランスフェクションしたこともある。今で言うハイスループット
スクリーニングのはしりかな。もちろんカラムなんて使わずにRNaseAかけ
て2-PrOH沈殿しただけのものをDEAEデキストラン法でトランスフェクシ

ンして、しっかり発現クローニングしました。

75 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/24 01:56
>74
おお!なるほど、それは猛者ですね!
けど、効率が下がったり、ばらついたりしないでしょうか?
それか、他のサイドイフェクトなんかも気になります。
不純物が悪さしそうです。
単に局在をチャックするなどならば、気になりませんが。。。

76 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/24 02:28
まあプラスミドは綺麗なほど良いわな、
ただのシーケンスでも読める長さが全然違うぜ。

しかし皆さんお金持ちだこと…
アルカリ法で32サンプル/dayの経験がある。

77 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/24 09:52
キアジェンで取ったDNAだってそれほどきれいじゃないよ。うちのフォトメータ
はUV吸収曲線を簡単に描いてくれるんで測ってみたけど、吸収スペクトルに肩が
出る。タンパク質の吸収とは違うから、何がコンタミしてるのか知らないけど
ね。慌ててフェノール抽出したら、僅かに中間層が見えた。

78 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/25 00:58
age

79 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/25 01:05
qiagen(Maxi)でとったDNAにフェノール抽出かけると、
わずかどころか、かなりの白い中間層が出る。
定量が合うわけないんで、一度はフェノールかけている。

80 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/25 01:10
>79
まじでっか?
そんなもん、トランスフェクションしても大丈夫なんかねー。

81 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/28 00:18
確かに、キアゲンでとったDNAは
吸光度から算出した濃度と、泳動して濃度既知DNAとの比較による値では
前者>後者だった。
なので、使うときは多めにしている。

82 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/28 14:11
あの中間層は何だ?

83 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/28 14:18
標準的な所得の世帯だよ。>中間層

84 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/03 19:47
amershamから出たFlexiPrep Kitって、
誰か使った人いない?
結構安いんだけど…
(\ 44/1.5 ml大腸菌培養液)

85 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/04 11:23
>84
愛用しています。名前のとうりミニからラージまでスケールをかえることができます。理由は不明ですがキアゲンまたはペグ沈精製のDNAで制限酵素で切断効率の悪いものも、これを使用するとよく切れたことがあった。

86 :山崎渉:03/01/11 13:46
(^^)

87 :山崎渉:03/01/18 13:22
(^^)

88 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 01:13



89 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/07 05:23
>>5 あたりにあるけど、ホストの大腸菌によっても変わってくるもんなの?

90 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/07 05:24
精製度とかそれに至るステップとか。

91 :山崎渉:03/03/13 13:41
(^^)

92 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/15 23:30
クラボウの抽出機(50だっけ?)がいいと思う
しかしでかい

93 :山崎渉:03/04/17 08:49
(^^)

94 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/18 00:55
制限酵素でプラスミド切った後、
PCR産物精製用のカラム(マイクロコンとか)じゃ
制限酵素は取り除けないですか?

95 :bloom:03/04/18 01:08
http://www2.leverage.jp/start/

96 :hoga:03/04/18 03:00
んなもんフェノクロすりゃいいし。

97 :山崎渉:03/04/20 03:59
   ∧_∧
  (  ^^ )< ぬるぽ(^^)

98 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/22 05:59
>>94
OKだと思われ。

99 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/22 11:10
heat inactivationぢゃ、ダメなのか?

100 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/22 11:49
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101 :山崎渉:03/05/21 23:51
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102 :山崎渉:03/05/28 14:40
     ∧_∧
ピュ.ー (  ^^ ) <これからも僕を応援して下さいね(^^)。
  =〔~∪ ̄ ̄〕
  = ◎――◎                      山崎渉

103 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/02 00:29
>>74, 75
超カメレスですが、、、
大腸菌からplasmid DNAを精製すると、内毒素、すなわち細胞外膜由来の
LPSが必ず混入します。LPSは、細胞内シグナル経路を介してNF-kappaB等
の転写因子を活性化します。LPSの受容体としては、CD14やToll-like re
ceptor (TLR)-4が知られており、これらの受容体を発現している細胞を用
いてトランスフェクション実験を行う場合には、夾雑したLPSによる活性化
を避けるためにplasmid DNAのグレードにはより注意を払う必要があります。
QIAGENから、エンドトキシン(内毒素)フリー用のMAXIキットも発売されて
いますので参考まで。

104 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/02 02:16
だから、COSで高発現ぐらいのレベルならendotoxinなんて問題にしなくて良いって文脈なんですけどね。

105 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/02 03:05
しかし、気亜現のミニでトランスフェクションはまずくね?
さらにクラボウのマシンでとったプラスミドなんてもっと。。。

106 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/02 09:50
昔、96穴プレートで大腸菌生やして、そのフォーマットでアルカリ法でプラスミド取って(RNase+イソプロ沈)、そのままCOSにトランスフェクションして発現クローニングしていましたが、何か?

107 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/02 13:43
で、効率は?

108 :_:03/07/02 13:47
http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

109 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/03 00:37
>>104
LPS感受性の低い細胞株なら問題ないですね。失礼しました。
>>106
ところで、106の方法は、『Current Protocol in Molecular Biology』に
紹介されてる方法と同じ方法でしょうか?

>>all
QIAGEN他で採用されているシリカメンブレンのスピンカラムですが、
DNAやRNAを吸着させるステップで、溶液中にカオトロピック塩が
含まれていなければならない理由がわかりません。
(そもそもDNAとシリカの結合のメカニズムがいまひとつよくわかって
 いないのですが。。。)
どなたか御存知の方がいれば、御教示下さい。よろしくお願いします。


110 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/03 20:00
LPS感受性でない細胞の方が多いのでは?
NIH3T3とかも問題ないわけね。

111 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/04 01:56
みなさんのマイベストプロトコルを教えてください
アルカリ法で中和したあとカラムを使わない方法とか。。。

112 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/04 12:40
★★完全無修正のエロエロサイト★★
http://upbbs.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html

 ↑ 
このサイトマジやばいです。早く見ないと消されちゃうかも・・・

113 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/04 19:27
http://plaza16.mbn.or.jp/~satchel/wareme_tatesuji/omanko/
美少女のワレメが丸見えでつ。(*´Д`*)ハァハァ

114 :山崎 渉:03/07/12 12:30

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
 |\⌒⌒⌒\
 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

115 :山崎 渉:03/07/15 12:56

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
 |\⌒⌒⌒\
 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

116 :なまえをいれてください:03/07/24 17:18
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ?(俺を買え)」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。)
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

117 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/25 01:47
だれかーー助けて。
単純なことなのです。クラボウのプラスミド抽出機(PI-50)、
チューブのセットって、左右のどっちがどっち???
こんな夜中に使いたいのに、わかんなーい。

118 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/25 05:38
説明書読むか、責任者に聞けや
どあほ

119 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/26 16:06
純度なら密度勾配遠心か?

120 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/26 19:31
画像集!
http://www.sexpixbox.com/pleasant/dx/index.html

121 :ぼるじょあ ◆yBEncckFOU :03/08/02 03:04
     ∧_∧  ∧_∧
ピュ.ー (  ・3・) (  ^^ ) <これからも僕たちを応援して下さいね(^^)。
  =〔~∪ ̄ ̄ ̄∪ ̄ ̄〕
  = ◎――――――◎                      山崎渉&ぼるじょあ

122 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/06 23:48
クラボウで、「除タンパク試薬」ってあるでしょ。
あれの成分分かるヒトいる?
ほかは分かったんだけど、それだけ不明なり。
あれが分かれば全てLABで作れて安上がり!

123 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/06 23:51
うちは「除タンパク試薬」だけは買って、他は自作してるけど、なぜか全部買った時より純度が低い。例えばフェノール・クロロホルムで抽出した場合の中間層が、自作だとテキメンに多い。何かトリックがあるに違いない。

124 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/06 23:57
うちのMD上がりのポスドク、キットが大好き。インサートがチェックできれば良いだけのミニプレップにまでキットを使ってるから、意味無い
んじゃないのってツッこんだら、キットを使えばsoln Iの後すぐにsoln
II、そのあとすぐにsoln IIIを入れられるけど、自前のミニプレだっ
たら5分待ってからsoln IIだし、soln III入れる前にさらに5分待た
なきゃいけないから時間の無駄なんだと!思わず小一時間…


125 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/07 00:08
ミニプレなんてキット以外でやったことないよw

126 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/07 01:43
皆さん、キットのシリカカラムって、何回くらい使いまわしてる?
soln I II IIIが先になくなってしまうんで自作したいんだけど、
soln IIIの組成がよくわからない〜ん。
シアン化グアニジンってなんのために入ってるん??

127 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/07 18:42
ってーか、スピンカラムはディスポだろ
それでなくても試薬が余る

128 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/07 19:21
>126 防腐剤

129 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/07 21:19
>>127
だね
再利用したら絶対コンタミしてる
そのままシーケンステンプレートにしかしないんなら若干のコンタミは大丈夫と思うが
サブクローンを取ったりPCRテンプレートにしたりするとまずいでしょ


130 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/08 00:46
>>126
シアンの有る無しでDNAをくっつけたり離したりする。

131 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/08 01:13
>>129
PCRは別に問題ないと思うし、サブクローンもセレクションすればいいだけと思うけど?
分生やってるひとって、根拠も考えず神経質になりすぎるよ。

132 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/08 01:34
>>126,130
なんだよそのシアンってのは。ニアピン賞アゲマス。

あれどこに書いてあったんだっけ・・
うちでは詰まって流れなくなりまで水で洗って使い回し。
sol3は25%ぐらいのグアニジン塩酸塩水溶液+酢酸カリウムバッファー
PBは自家製sol3 0.75mL、PEは70%エタノール0.75mLで代用
グアニジン塩の濃度はもっと高いほうがいいような気がする。
確かミリポァ〜の自動機械は10Mぐらいのやつを使ってたと思う。

このスレをながめてみればいろいろ勉強になるはず。
  「実験の裏技ありますか??」2   
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/996490423/

うちでは最近PCRがうまくかからないのが出てきたのでインサートチェックで
ミニプレ→制限酵素が復活中

>>131
一回洗い忘れたやつでとったプラスミドをシークエンシングに送っちゃって
先生に怒られました。データも無茶苦茶だったです。。

133 :126:03/08/08 02:09
みなさん、レス、サンキュです。

>>127, 129
前サンプルからのクロスコンタミはもちろん承知の上。
だから次のステップ以降で微小のコンタミでも問題になるような場合は、ニューカラム。
でも形質転換後のインサートチェックとか、材料を次の操作に持ち込まないような場合
には多少のコンタミがあっても影響ないでしょ?(電気泳動で見えないし)
いっぺんにたくさん使うし、ディスポにしちゃうのもったいなくないですか?

>>126, 130
QIAGENのHPも見てみたんですが、シリカと核酸の結合に必要みたい?
詳しい理屈とかはよくわからなかったんだけど・・・

134 :126:03/08/08 02:33
>>131
キット使うときは、なるべくその原理まで理解するよう努力はしてるんですけど、
企業秘密っぽいところもあってなかなか・・・ 
オリジナルの文献とかマニュアルに書いてない場合、どうやって調べてますか?

>>132
塩酸塩でしたか・・・(適当なことかいてスイマセンでした) 
とにかく詳細サンキュです。助かりました。参考にさせていただきます。
N3は、sol 3 にグアニジン塩酸塩を高濃度添加。濃度は要検討と。
PBは、イソプロパノールの匂いがしますよね?
PEは、Trisがベースなんかな?



135 :_:03/08/08 02:33
http://homepage.mac.com/hiroyuki45/jaz10.html

136 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/08 09:40
でも目的がインサートチェックやシーケンスなら、なんでわざわざカラムなんか使うのかわかんないんだけど。
コストはともかく、集菌→soln I→soln K→soln L→遠心して上清取る、ってとこまでは同じ手間で、その後イソプロ沈する方が、ちまちまカラムをセットしたり洗ったりするよりよっぽど楽だと思うけど。

137 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/08 10:04
>>134 
MSDSには塩酸塩って書いてあるけど本当はチオシアン酸塩らしい
N3もPBも起亜のMSDSにだいたいの濃度が書いてあるよ
2種類用意するのがめんどくさいので両方偽N3でやってます
あ、そういえば、EBの代わりはTEですね

原理はカオトロピック塩高濃度存在下、核酸がガラスにベタベタ吸着するのを利用してるようです。
そういう意味ではRNAの方がよくくっつくみたいで、P1にRNaseを入れるのは必須のようです。

>>136 そういわれればそうかも ただ単に慣れの問題?

138 :565454546:03/08/08 10:14
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871320760
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871244644
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871244663
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871244709
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871244737
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871457383
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871244813
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871482337
http://ck.jp.ap.valuecommerce.com/servlet/referral?sid=2120992&pid=871502491

139 :131:03/08/08 13:58
>>132
洗わないでダイレクトシーケンスしたの?ならだめだね。
プライマーが同じなんだから、そこはちょっと考えてもらわないと。

>>134
そんな秘密はないはずだけど・・・というか、何でもキット使おうとするから
わからないんだよ。基本の方法をちゃんと知ってれば、キットが何をしてるか
すぐわかる。そして、キットを使っても楽にならない、収量もあがらない、
精製度も上がらないことが多いのもよくわかる。
もちろん、キット使ったほうがいい場合もあるけど。

>>136 だよね。

140 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/09 23:29
いや、試薬の組成は聞いても教えてくれない。
まぁ、さほど複雑なはずはなく推測できるけどね。

141 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/09 23:34
プロメガはミニプレップとPCR生成・ゲル生成キットでスピンカラムが共通なのがいい。
試薬も別売りしてくれるとか。
キアゲンは試薬が必ず余って、カラム別売りしない殿様商売ぶりが嫌い

142 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/10 02:34
>>140 そんな組成が知りたいのか? その真意はなに? 本質は?

143 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/11 18:17
しらないお前らがばか。

論文嫁

144 :山崎 渉:03/08/15 18:10
    (⌒V⌒)
   │ ^ ^ │<これからも僕を応援して下さいね(^^)。
  ⊂|    |つ
   (_)(_)                      山崎パン

145 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/20 00:16
age

146 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/25 22:51
miniPrepではないが、プラスミドの抽出にはトランスフェクション用にはQIAGENのHiSpeedを使っている。
インビトロジェンのConcertが良かったがもう売っていないようで残念だ。

147 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/25 23:10
HiSpeedはいいけど高い

148 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/25 23:50
へー、concertなくなったの?miniが?
そのHispeedってのはminiであるの?倍以上の値段?
ごちゃごちゃ聞いてすいません。

149 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/26 00:33
ヲレはいまでもアルカリSDS、K-acetate、イソプロ沈澱の後、CsCl超遠心2回ですが、何か?

150 :146:03/08/26 23:14
調べてみたらConcertは船越に販売権が移ったようだった。スマソ。
ttp://www.invitrogen.co.jp/info/oshi030305.shtml

QIAGENのHiSpeedはここに載っているよ。Miniはないみたいだね。
ttp://www.qiagen.com/catalog/auto/cget.asp?p=HiSpeed_plasmid&l=jp

151 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/26 23:23
>150
レスありがとうです。
HiSpeedのミニがないのが残念です。

152 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/26 23:29
上にも何度も出てきたが、ミニプレップの段階でそんなに精製度の高いものが必要な理由ってあるの? 残念とまで言ってますけど↑この人。

153 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/26 23:36
>152
なんで疑問なの?
そりゃ、スモールスケールで取ったプラスミドを
高効率でトランスフェクションするには精製度の高いミニがいいでしょ?
ラージスケールで多種類のプラスミド精製するの大変だし。

154 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/26 23:44
いったいトランスフェクションに何μgのDNAを使うのかと小一時間…

155 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/26 23:52
>154
1マイクロだけど???何が言いたいんだ?

156 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/27 00:05
154は小一時間説教されたかったわけね w

157 :sage:03/08/28 23:48
QIAGEN
キットは良いが、人事のババァが最悪。

158 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/28 23:52
買って使う側に取っちゃ、人事のことなんて関係ないけどね

159 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/28 23:53
>>157
しかも、それじゃあsagaってないぞ

160 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/31 20:38
高純度プラスミドなんていって、某機械?メーカーが
アンケートとってたが、アホか。
いらねーよ、そんなん。数百万もだして。

161 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/31 22:34
蔵ボーのミニプレップが一番慣れています、

一度に160本

162 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/01 09:48
蔵ボーは時間かかりすぎ。たった24本で2時間半だもん。

163 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/01 19:48
>162
もっと早いのあるかっての?

164 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/01 19:49
http://www.39001.com/cgi-bin/cpc/gateway.cgi?id=mayumi

165 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/05 22:20
味煮婦烈婦も裸味婦烈婦も嫌いです。

166 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/07 19:48
クラボウ以外に自動の機械あるの??

167 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/07 20:06
>>166

カラム方式のミニプレップマシンがあり、トランスフェクショングレード
ですが、1サンプル当たりのコストがバカ高いです。

168 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/07 22:07
>>162
24のじゃなくて、48のヤツ。たしか50aとか、そんな名前のが
あるはず。2時間半かからんのでは?

169 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/07 22:16
その間、文献読むとか別の実験すすめるとかすれ>二時間半

170 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/09 18:45
>168
それいいでつね!

171 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/22 04:16
>>166
ミリポア

172 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 16:49
キアゲンのキットって性能はいいの?
よかったら纏め買いしようと思うけど、その場合は結構安くなるの?

173 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 22:17
企業秘密って、、、
お前らパテントのしかもクレームくらい見ないの?
誰かからバッファの組成でも尋ねられたらどうするの?
「キット使ってるから知らないんですよ」とか言う?

174 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 22:18
プラスミドなんて一日あれば増やして精製まで簡単ですが。

175 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 01:03
BioMecとミリポアの組み合わせで96サンプル約小一時間のシステムがある。
でも、大量のサンプルを扱わない人にはお金の無駄。


176 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 13:48
ちょっと、質問。
ミニじゃなくて悪いが、midiキットで回収後、吸光度が1.7位
フェノエタやると、なんか白い層がでて吸光度が1.6と帰っていつも
下がってしまうのだが、何でだ??フェノエタ 前中間層込みの吸光度がいい
のはなんでだろう??


177 :期限切れ助手:03/10/17 13:50
>176スペクトルチェックしてますか?

178 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 13:53
すいません、スペクトルチェックとは、機械のキャリブレーションの
事ですか?

179 :期限切れ助手:03/10/17 14:40
>178
いえいえ、そうじゃないです。
おそらくOD260/OD280の比較をしているのだと思われますが、
スペクトルを測定した方が不純物があったときはっきりするのではないかと思ったのです。


180 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/18 07:53
そゆのは簡易型の吸光度計ではできない罠
あまりシビアな実験でないなら
沈殿の大きさとか
溶かしたときの粘り具合とか
ゲルに流したときのバンドパターンとか
で判断できる


181 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/18 13:42
>>176 OD260/OD280の比率が核酸の純度を反映しているというのは、あくまでコンタミしているのがタンパク質や脂質である場合のみでしょ。フェノール抽出の後、クロロホルムでも抽出してる?

182 :やよい:03/10/18 15:20
http://life.fam.cx/a014/

183 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 09:12
176です。
うちは、簡易の吸光度しかないです。すみません。
後、PCI後、CIA1回処理しています。

184 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/21 00:28
RNAはどうやってとってる?

185 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 22:06
蔵簿う、また壊れた。今年二度目

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